纯化水微生物限度(纯化水微生物限度检查思考)

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纯化水微生物限度

编者按:整理了一下之前发的几篇旧文,补个原创。增加了一些新的认识
中国药典2015年版规定纯化水微生物限度检查:取本品不少于 1ml,按薄膜过滤法处理后,采用 R2A 琼脂培养基,30~35℃培养不少于 5 天,依法检查(通则 1105),每1ml供试品中需氧菌总数不得过100cfu。   

问题1:过滤体积,1ml,10ml还是100ml?
中国药典2015年版规定纯化水微生物限度检查:取本品不少于 1ml。美国药典(USP)欧洲药典(EP)中都是取10ml混合均匀的水样。还有人说过滤100ml更适合反映真实的情况。        
过滤的越多越能体现真实的微生物限度水平,这是基本的共识。但是便于之后的计数是我们不得不考虑的内容。一般来说在每个平板上形成30~300个菌落属于有效计数范围。如果过滤体积过大,滤膜上的菌落超过300cfu就会有边界模糊的现象造成无法准确计数。有些公司的微孔滤膜上会带有方格,一般为180-200个左右,就是为了方便计数。       
 那我们到底要过滤多少体积呢?最好结合本公司的纯化水的微生物限度值历史数据水平尽量多过。极端的说,如果你公司纯化水历史数据都是0,那可以取多少纯化水过滤多少。如果从纯化水的微生物限度标准(1ml需氧菌总数不得过100cfu)来说,过滤3ml比较合适,只要在合格范围以内,每膜不超过300cfu方便计数。折中的情况,过滤10ml是比较多的选择,但是如果你公司的纯化水历史数据维持在30cfu/ml以上,过滤10ml的话膜上会长出300cfu以上的菌落,就太多了不好计数了。        
再多说一句,为了取样有代表性,国外药典中要求的混合均匀是好的操作。引申思考,注射用水(100ml需氧菌总数不得过10cfu)微生物限度检查过滤100ml,1000ml还是多少?

 
问题2:: 为什么是R2A琼脂培养基       
 为什么选择R2A琼脂培养基检测纯化水?为了和美国药典(USP)欧洲药典(EP)接轨?这只是表面的一个结果。那到底是为什么呢?我们首先要了解一个假说:由于微生物生理生化特征的多样性,没有哪种培养基将水样中存活微生物全部检出,每种培养基都趋向于只计数适应该种营养条件的一类微生物。如果某种培养基的选择性弱,则可检出更大量的微生物。而且纯化水管网要周期性的进行消毒剂消毒、加热消毒冲洗等日常维护,再加上纯化水中营养缺乏,其中的微生物一般处于结构或代谢破损状态。R2A 琼脂培养基就是一种低营养培养基,选择性弱,适合破损微生物的恢复性生长以致顺利检出。        
微生物在R2A 琼脂培养基上的生长速度较慢,形成的菌落要小,48小时之内很难准确计数。按照药典要求30~35℃培养不少于 5 天。有研究表明,降低培养温度(28℃甚至20℃),增加培养时间(12-14天),R2A琼脂培养基上的菌落数能达到最高,但是这种长期培养并不适合日常检验,倒是可以在污染调查时使用,防止有些微生物能在纯化水中存活但是不能检出的情况。       
 再多说一句,微生物的世界是十分复杂的,在美国药典中为了防止有不符合之前假说的情况同时规定了PCA琼脂培养基(一种高营养培养基)的检测,结果与R2A琼脂培养基的结果比较,二者相比取多者。
 
问题3:: 方法学验证
最近经常看到网上的讨论:纯化水微生物限度检查法适用性试验要不要做?我也不能肯定的回答要或者不要,但是我很想从另一个方面的聊一聊。
 
中国药典原文:供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适用性检查。供试品的微生物计数方法应进行方法学适用性试验,以确认所采用的方法适合于该产品的微生物计数。若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时,计数方法应重新进行适用性试验。
一般情况下,如果药典品种项下已经规定好的方法不需要方法学验证。但是如果有人质疑你的具体操作方法:比如冲洗液是用多少体积,什么类型,过滤体积多少更能反映本公司纯化水质量等等,有时候会有些气短词穷。
看了一些网上已经有的验证方案,再回顾了一下上文的药典要求,会有一些发现。
如果方案里菌种计数时用了TSA或者SDA,那是不合适的。
如果方案里没有规定好纯化水的取水位置,那是不合适的。
如果方案里没有对纯化水取水的时机进行讨论,那是不合适的。
……
综上,计数时最好也是R2A培养基,不然就用定量菌种。不同取水口,不同取水时机,不同的保存时间等等可能导致纯化水的质量有很大不同。如果没有在验证中考虑这些,那还不如不做。

问题4:纯化水微生物监测的意义
纯化水之所以有微生物限度的控制,是因为要尽量防止纯化水在使用过程中以及变成产品的一部分时微生物的过量生长造成产品质量问题。但是对于即用或连续供应的制药用水,微生物标准不合用。微生物标准的评估要用检测方法,按照中国药典耗时不少于5天方能得到结果。制药用水一般连续生产,制好后即在产品和生产过程中使用,检测结果出来前,水已经用过了。如果水的质量不符合药典规定,则要对情况进行调查,并对前次合格结果和后次检验合格结果之间的全部批号的产品,做出放行还是不放行的决定。对于医疗器械企业来说,情况也是差不多。检测的纯化水至少5天之后才出微生物结果,不可能等5天再用。而且,5天后的纯化水也一样了。这就是不能实时检测的结果,无法避免。
在这种情况下,监测应该重于检测。相比较关注于纯化水检测方法要不要验证,更应该关注制水系统的验证,应在控制下运行和保养,以保证其运行的适用性。设定合适的实时监测指标(电导率、TOC等),微生物检查应定量监控,对照设定微生物警报和行动水平,以提供系统控制的早期指示。
石决明
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